Close

Bioanalisis: Pengembangan dan Validasi Metode Bioanalisis dari Lamivudine Menggunakan Metode RP-HPLC


logo unej

MAKALAH BIOANALISIS

Pengembangan dan Validasi Metode Bioanalisis dari Lamivudine Menggunakan Metode RP-HPLC

 

 

 

 

 

 

 

Disusun oleh :

IcaEvita Maulidah

112210101043

 

 

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2015


KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena dengan rahmat, karunia, serta taufik dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Pengembangan dan Validasi Metode Bioanalisis dari Lamivudine Menggunakan Metode RP-HPLC” ini dengan baik meskipun banyak kekurangan didalamnya.

Penulis sangat berharap makalah ini dapat berguna dalam rangka menambah wawasan serta pengetahuan mengenai bioanalisis pada manusia. Penulis juga menyadari sepenuhnya bahwa di dalam makalah ini terdapat kekurangan dan jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu, penulis berharap adanya kritik dan saran demi perbaikan makalah yang telah penulis buat di masa yang akan datang, mengingat tidak ada sesuatu yang sempurna tanpa saran yang membangun.

Semoga makalah sederhana ini dapat dipahami bagi siapapun yang membacanya. Sebelumnya penulis mohon maaf apabila terdapat kesalahan kata-kata yang kurang berkenan dan mohon kritik dan saran yang membangun demi perbaikan di masa depan.

 

 

 

Penulis


DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan

BAB 2. PEMBAHASAN

2.1 Eksperimental

2.2 Penentuan Linieritas

2.3 Penentuan Akuras, Presisi dan Recovery

2.4 Spesifisitas dan Selektivitas

2.5 Uji stabilitas

2.6 Ruggedness

BAB 3. PENUTUP

3.1 Kesimpulan

DAFTAR PUSTAKA

 


BAB 1. PENDAHULUAN

1.1           Latar Belakang

       Lamivudine awalnya dikembangkan untuk pengobatan infeksi HIV. lamivudine enansiomer  dari 2′-deoksi-3′-thiacytidine merupakan analog nukleosida di mana 3 ‘karbon ribosa dari zalcitabine telah digantikan oleh belerang. Enansiomer dari campuran rasemat menunjukkan sitotoksisitas jauh lebih sedikit dibandingkan enansiomer positif. Meskipun umumnya kurang kuat dibandingkan AZT atau zalcitabine dalam menghambat replikasi in vitro HIV-1 dan HIV-2, lamivudine memiliki sitotoksisitas seluler yang sangat rendah. Hal ini menyebabkan penghambatan kompetitif aktivitas reverse transcriptase terhadap dCTP. Setelah pemberian oral, lamivudine cepat diserap dengan bioavailabilitas sekitar 80%. Lamivudine juga menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap HBV in vitro dan manusia yang terinfeksi secara kronis. Struktur kimia dari lamivudine ditunjukkan di bawah ini (Gambar 1).

Gb1

              Lamivudine (3-TC), 2′-deoksi-3′-thiacytidine, kurang kuat dibanding AZT dan zalcitabine, tetapi rejimen antivirus yang termasuk 3-TC sangat diharapkan, sejak 3-TC telah terbukti terbilang kurang beracun dibandingkan NRTI lainnya. Selain itu, lamivudine aktif terhadap HIV yang resisten terhadap AZT. US Department of Health and Human Services saat ini menganjurkan 3-TC dalam kombinasi dengan NRTI lain, baik PI atau efavirenz untuk pengobatan infeksi HIV. Mekanisme kerja dari lamivudine tampaknya mirip dengan AZT. 3-TC memiliki sekitar 80% bioavailabilitas oral pada manusia dengan dosis 150 mg dua kali sehari atau 300 mg sekali sehari dalam kombinasi dengan ARV lain. Dalam dosis tersebut, senyawa ini ditoleransi dengan baik.

               Beberapa metode HPLC dengan deteksi ultraviolet untuk penentuan 3-TC dalam cairan biologis telah diterbitkan. presipitasi protein digunakan dengan asam trikloroasetat untuk sampel pembersihan untuk analisis 3-TC dalam serum manusia. Metode ekstraksi fase padat (SPE) telah dikembangkan oleh penulis yang berbeda. dimasukkan skema beralih ke kolom prosedur untuk mengukur 3-TC dalam urin. Metode kuantifikasi lain untuk 3-TC termasuk radioimmunoassay dan spektrometri massa.

1.2           Rumusan Masalah

        Apakah pengembangan dan validasi metode bioanalisis HPLC lebih menyederhanakan analisis dan menunjukkan akurasi, spesifisitas dan reprodusibel yang baik untuk kuantifikasi 3-TC dalam plasma manusia?

1.3           Tujuan

            Makalah ini menjelaskan tentang pengembangan dan validasi metode bioanalisis HPLC yang sensitif, spesifik, cepat, sederhana dan ekonomis untuk kuantifikasi 3-TC dalam plasma manusia, merupakan preparasi sampel one-step menggunakan metanol yang menyederhanakan analisis lamivudine dalam plasma manusia. Contoh handling dan run times kromatografi yang diminimalkan untuk memberikan hasil kuantitatif yang cepat dengan tetap menjaga spesifisitas akurasi dan presisi yang diperlukan untuk evaluasi lamivudine.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


BAB 2. PEMBAHASAN

2.1         Eksperimental

              Analisis dilakukan pada instrumen ilmiah Shimadzu yang terdiri dari LC-20 AT pump dan SPD- 20 AT variable wavelength detector. Pemisahan senyawa dilakukan menggunakan Kolom Phenomenex Luna C18 (5μm, 25cm X 4.6mm i.d). Dilakukan preparasi stok larutan standar dari lamivudin dan standar internal dengan melarutkan sejumlah senyawa dalam campuran metanol-air yang disimpan pada suhu 4⁰C. Blanko darah manusia dikumpulkan dengan heparin dari sukarelawan sehat dan bebas narkoba. setelah disentrifus pada 5000 rpm dalam suhu kamar, plasma dikumpulkan dan disimpan pada -30⁰C.

            Kondisi kromatografinya yaitu fase gerak yang digunakan adalah metanol dan air (85: 15% v / v). Sebelum dilakukan analisis, fase gerak disaring melalui filter 0,4 um, kemudian diultrasonic selama 15 menit. Analisis dilakukan pada laju alir 1,0 ml / menit. Eluen dipantau pada panjang gelombang 270nm untuk lamivudine. Total run time 10 menit.

          Pengendapan protein dilakukan dengan menyiapkan sampel plasma blanko dengan menambahkan 1 ml plasma dan 1 ml metanol , kemudian di vortek selama 30 detik. Lalu disentrifus pada 4⁰C, 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan cair diambil dan dipindahkan ke botol  HPLC.

2.2           Penentuan Linieritas

          Kurva Standar disiapkan dengan menyuntikkan berbagai konsentrasi lamivudine dalam plasma. konsentrasi plasma dan kontrol kualitas sampel dihitung dengan menggunakan persamaan regresi garis lurus y = mx + c. Metode ini divalidasi selama rentang 406,20-4020,05 ng/ml. Diperoleh slope 86,139 dan koefisien korelasi 0,9999.

         Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) ditentukan sebagai berikut: 6 sampel kosong dari enam subjek yang terpisah untuk masing-masing analit dan matriks diekstraksi dan dibandingkan dengan standar rendah setiap analit. Puncak yang jelas ada pada waktu retensi sama dengan analit, konsentrasi dihitung pada puncak ini. Ada serangkaian puncak noise kecil pada waktu retensi sama dengan analit, ketinggian noise diukur dan dibandingkan dengan ketinggian standar rendah. Hal ini memberikan “konsentrasi” untuk noise. Rata-rata dari 6 “konsentrasi noise” dihitung dan kalikan dengan salah satu dari 3 (LOD) atau 5 (LOQ). Nilai LOQ kemudian dikonfirmasi menggunakan enam replikasi spiked pada konsentrasi target sebagai penerimaan varian 20%. Hasil yang diperoleh untuk manivudine yaitu 200 ng/ml untuk LOD dan 400 ng/ml untuk LOQ.

2.2           Penentuan Akurasi, Presisi dan Recovery

             Akurasi dan presisi dari metode ditentukan dengan pengujian dua sampel replikasi plasma pada 3 konsentrasi lamivudine yang berbeda (3420,06, 2052,04 dan 1.026,02 ng/ml) yang berjalan pada 6 analitis. akurasi diukur sebagai deviasi persen dari nominal konsentrasi.

     Recovery absolut dari lamivudine dan S.I ditentukan berdasarkan perbandingan luas puncak dari sampel non-ekstraksi dan ekstraksi dari QC-3 dalam replikasi. Recovery dihitung sebagai standar deviasi relatif dari rata-rata (RSD) dengan RSD (%) = (Standar deviasi dari mean / rata-rata) x 100.  Dihasilkan %recovery lamivudine 97,55% dan S.I 98,11%.

2.3            Spesifisitas dan Selektivitas

         Spesifisitas dan selektivitas diperiksa dengan melihat gangguan dari senyawa endogen yang dianalisis berdasarkan analisis blanko plasma manusia dari 6 relawan bebas narkoba. kromatogram plasma diperiksa yang mungkin co-mengelusi dengan 3-TC.

2.4              Uji Stabilitas

             Uji Stabilitas larutan dari 3-TC diuji dalam larutan standar analitis, ekstrak sampel dan matriks biologi diproses dengan perbandingan sampel plasma spiked baru. Stabilitas larutan 3TC dan Stavudine dalam metanol dan air (85: 15% v / v) disimpan pada 10°C diperiksa selama 6 bulan. Larutan standar dari 3-TC dan Stavudine disiapkan seluruh tahap pengembangan metode penelitian dan disimpan pada 10°C. Larutan ini dibandingkan dengan standar baru dari 3-TC dan Stavudine. Larutan standar dipreparasi dalam fase gerak dan disimpan pada 10°C dengan kestabilan selama minimal 6 bulan. Larutan stok dari lamivudin dan S.I harus stabil dalam suhu penyimpanan suhu ruang selama 8 jam untuk short term stock stability, selama 45 hari untuk long term stock stability. Didapatkan hasil 12 jam dan 30 hari masing-masing untuk short term stock stability dan long term stock stability. Konsentrasi rendah dan tinggi dari replikasi kontrol kualitas sampel ditentukan dengan membandingkan rasio mean area dari sampel baru yang dicairkan dimana disimpan pada suhu kamar selama 6 jam untuk bench top stability dan selama 24 jam untuk coolant stability. Hasil menunjukkan 12 jam dan 7 hari masing-masing untuk brench top stability dan Coolant stability. Stabilitas tinggi dan rendah dari kontrol kualitas sampel ditentukan setelah tiga siklus freeze thaw, persen degradasi ditentukan dengan membandingkan rasio mean aren dari lamivudine (Freeze thaw stability). Untuk long term plasma stability setidaknya tiga aliquot dari masing-masing konsentrasi tinggi dan rendah pada kondisi yang sama sebagai sampel penelitian. Analisis pada tiga kesempatan terpisah. waktu penyimpanan harus melebihi waktu antara tanggal pertama pengumpulan sampel dan tanggal analisis sampel yang telah berlalu, kemudian didapatkan hasil uji long term plasma stability yaitu 60 hari.

2.5         Ruggedness

             Ruggedness dari suatu metode analisis merupakan tingkat reproduktifitas hasil tes yang diperoleh dengan analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi pengujian normal. Ruggedness dari metode ini diuji dengan mengubah kondisi eksperimental seperti:

–        Mengubah ke kolom lain dari jenis yang sama (Phenomenex Gemini C18)

–        Pengoperasian yang berbeda di laboratorium yang sama.

tabel 1
Tabel 1. Hasil Analisis
a
Gambar a. Kromatogram dari blanko plasma manusia

 

b
Gambar b. Kromatogram dari blanko plasma spiked dengan 3-TC dan Stavudine

BAB 3. PENUTUP

 3.1           Kesimpulan

         Pengembangan metode bioanalisis ini sederhana dan menunjukkan akurasi, spesifisitas dan reprodusibel yang baik. Hal ini dapat digunakan untuk estimasi Lamivudine di biofluids. Metode pemisahan yang dikembangkan menghasilkan nilai recovery yang dapat diterima. Kromatogram puncak lamivudine telah diselesaikan tanpa gangguan apapun. Pengembangan metode ini dapat diterapkan dalam studi bioekivalensi, farmakokinetik dan toxicokinetic.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


DAFTAR PUSTAKA

 

Jayaseelan S, et al. 2010. Bioanalytical Method Development And Validation Of                            Lamivudine By Rp-Hplc Method. India: Department of Pharmaceutical                      Analysis


Makalah Bioanalisis_Ica Evita M_112210101043

jurnal_BIOANALYTICAL METHOD DEVELOPMENT AND

0 thoughts on “Bioanalisis: Pengembangan dan Validasi Metode Bioanalisis dari Lamivudine Menggunakan Metode RP-HPLC

  1. Компания http://obmenneg.com/ является автоматическим и круглосуточным онлайн -сервисом, который позволяет обменять средства. И для этого нет необходимости выходить из дома. Так получиться осуществить обмен между системами, банковскими картами, криптовалютами. Но самое главное, что сервис работает круглосуточно, а потому совершить операции вы можете в любой час. При помощи полной автоматизации удалось добиться важных преимуществ перед аналогичными компаниями:

    1. Все операции происходят очень быстро, включая обмен w1 webmoney
    2. На минимальную сумму обмена влияют требования определенных платежных систем
    3. Обмен можно осуществлять в любое время: поздно ночью, либо ранним утром
    4. Из-за того, что издержки минимальны, то и комиссия взимается символическая

    Все эти преимущества создают необходимые предпосылки для того, чтобы обратиться за помощью именно в эту компанию. Так вы потеряете минимум времени и денег. Воспользуйтесь услугами компании, которая дорожит клиентами и выполняет все обязанности на высшем уровне.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

© 2019 bioanalysis in human plasma | WordPress Theme: Annina Free by CrestaProject.
Skip to toolbar